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分析指南手册:早期药物发现的体外和体内分析指南

约翰娜·李和玛丽埃尔·莫恩斯

Promega公司
出版日期:2018年12月,tpub 191

摘要

《分析指南手册》是为在药物开发早期阶段工作的科学家提供的指南。该手册包括用于药物开发的各种体外和体内分析方法的选择、开发和优化指南。在本文中,我们重点介绍了《检测指南手册》中关于细胞活力测定、短串联重复谱分析和用于检测蛋白质相互作用的基于细胞的测定的三章。

简介

在药物开发的早期阶段,正确使用体外和体内试验对药物评价至关重要。但是你从哪里开始呢?你应该使用哪种分析方法?你如何分析和验证结果?

为了帮助回答这些问题,美国国立卫生研究院化学基因组学中心(NCGC)出版了一本电子书实验指导手册(AGM)。这本电子书最初是一家制药公司的内部指南,但现在包含了40多个章节,作者是来自学术、政府和工业研究实验室的药物发现科学家。AGM电子书包括各种体外和体内检测方法的选择、开发和优化指南,以及如何将这些检测方法应用于高通量筛选。它还提供了关于商业产品、潜在的检测干扰和检测性能的统计验证的信息。leyu乐鱼网

Promega的科学家在年度股东大会上贡献了三章;一项是细胞活力测定,另一项是使用短串联重复序列(STR)分析验证人类细胞系,第三项是检测蛋白质相互作用的基于细胞的测定。我们在本文中重点介绍这三章。

细胞生存能力分析

常用哪些方法来测量细胞活力?

在高通量工作流程中检测细胞活力的最常见方法之一是测量ATP,它只在活细胞中合成。ATP可以用含有稳定荧光素酶和荧光素底物的试剂进行生物发光测定。在活细胞ATP存在的情况下,荧光素酶利用荧光素产生发光,用发光计检测。产生的发光信号与活细胞的数量成正比。由于该方法在高密度微井板中具有优越的灵敏度,因此非常适合于高通量应用。

许多较老的细胞活力测定法需要试剂与活细胞孵育,将底物转化为可被具有吸收或荧光能力的平板读取器检测到的彩色或荧光产物。产生的信号与存活细胞的数量成正比,因为死亡细胞失去了将底物转化为产物的能力。这是许多常用的细胞活力测定的基础,包括四唑还原(如MTT或MTS),再蓝嘌呤还原和活细胞蛋白酶活性测定。这些测定方法比生物发光方法灵敏度低,用于低通量应用。

如何实时监测细胞活力?

Promega开发了一种实时细胞活力测定方法(见下图)。在本试验中,将工程荧光素酶和原底物(不是荧光素酶的底物)直接添加到培养基中。原底物可以穿透细胞膜进入细胞。然而,只有具有活跃代谢的活细胞才能将原底物还原为荧光素酶的底物。然后,底物离开细胞,在那里被检测试剂中的荧光素酶使用,产生发光信号。同一口井可重复测量3天。这种方法的主要优点是它允许使用较少的平板和细胞进行简单的动力学监测,以确定剂量反应。此外,由于该方法不需要细胞裂解,同样的细胞可以用于额外的细胞基础分析或下游应用。

Promega产品:RealTime-Glo™MT细胞活力测定(猫。# G9711)

RealTime-Glo™MT细胞活力测定概述

ATP细胞活力测定是如何工作的?

ATP可以用来检测细胞活力,因为只有存活的细胞才能合成ATP。ATP可以用生物荧光法测定,试剂中含有洗涤剂、稳定的荧光素酶和荧光素底物。洗涤剂溶解活细胞,释放ATP到培养基中。在ATP存在的情况下,荧光素酶利用荧光素产生发光,可以在10分钟内用发光计检测到(见下图)。ATP检测比其他方法更快,因为它不需要孵育将底物转化为彩色产品。该方法灵敏度高,线性宽,与高通量测定方法高度兼容。与其他方法相比,它也更不容易产生工件。

Promega产leyu乐鱼网品:CellTiter-Glo®发光细胞活力测定(猫。# G7570),CellTiter-Glo®2.0试验(猫。# G9241)

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蛋白酶活性标记试验是如何工作的?

一些蛋白酶活性在细胞死亡后迅速消失,因此它们可以作为存活细胞的有用标记。活细胞蛋白酶活性可以用细胞渗透性荧光蛋白酶底物(GF-AFC)测定。底物进入活细胞,被活细胞蛋白酶裂解,产生与活细胞数量成正比的荧光信号(见下图)。这种方法的培养时间为0.5-1小时,比四唑法的培养时间(1-4小时)短。由于这种方法不裂解细胞,它允许在同一样品孔中与许多其他测定方法进行复用,包括基于生物发光细胞的测定。

Promega产品:CellTiter-Fluor™细胞活力测定(猫。# G6080)

细胞滴度-荧光细胞活力测定化学。

再蓝嘌呤减少细胞活力测定是如何工作的?

再青嘌呤是一种细胞渗透性氧化还原指示剂,呈深蓝色,具有少量的荧光。只有代谢活跃的活细胞才能将再青嘌呤还原为间苯硫芬,呈粉红色和荧光。孵育1-4小时后,用微板分光光度计或荧光计对信号进行量化。这种方法相对便宜,比四唑法更灵敏。然而,被测化合物的荧光可能会干扰再间苯二酚的读数。

Promega产品:CellTiter-Blue®细胞活力测定(猫。# G8080)

四唑还原细胞活力测定是如何工作的?

用于检测活细胞的四唑化合物分为两类:

  1. 带正电荷的化合物(MTT)很容易穿透活细胞:具有活跃代谢的活细胞能够将MTT转化为紫色的福马甲产品。因此,颜色的形成可以成为活细胞的有用标记。然而,这种方法的培养时间很长(通常是4小时)。此外,福尔马赞产品是不溶的,所以在记录吸光度读数之前必须添加溶解试剂。
  2. 不穿透细胞的带负电荷的化合物(MTS, XTT, WST-1):这些化合物必须与中间电子偶联试剂结合,这些中间电子偶联试剂可以进入细胞,被还原,然后离开细胞,将四唑转化为可溶的福马甲产品。这种方法的培养时间为1-4小时。由于得到的福马赞是可溶的,因此不需要添加增溶剂,使其更方便。

所有四唑还原测定法的一个缺点是,它们依赖于彩色或荧光产物随时间的积累。leyu乐鱼网由于信号随着时间的推移逐渐增强,在这一长时间的孵育过程中无法检测到存活细胞的减少。

Promega产leyu乐鱼网品:CellTiter 96®非放射性细胞增殖试验(猫。# G4000),CellTiter 96®水溶液细胞增殖(猫。# G3582)

下载实验指导手册了解更多关于这些细胞活力测定。

细胞毒性检测

常用哪些方法来测量细胞毒性?

有两种常用的估计死亡细胞的方法;这两种方法都利用了膜完整性的丧失和指示分子分裂成一个隔间的能力,如果细胞膜是完整的,这是无法实现的。如下图所示,用于检测死亡细胞的分析方法包括测量某种成分(通常是酶标记物)从细胞质渗漏到培养基中,或一种非渗透性染料渗透到细胞膜受损的细胞中。

Promega产leyu乐鱼网品:CytoTox-Glo™细胞毒性试验(猫。# G9290),CytoTox-Fluor™细胞毒性试验(猫。# G9260)

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台盼蓝染色是如何工作的?

用台盼蓝对死亡细胞进行选择性染色,并在血细胞计上进行显微镜检查,是测定细胞数量和细胞活力百分数最常用的常规方法之一。一般的概念是台盼蓝被排除在活细胞之外,但穿透有受损质膜的死细胞。

台盼蓝染色技术通常用于单个样品或来自简单实验的相对少量的样品。该技术的主要缺点是:测量单个样本时的误差,用户在确定什么是死细胞或染色碎片时的主观判断,操作人员之间的不一致,以及测量多个样本所涉及的时间和人工劳动。

如何为细胞毒性试验选择荧光dna结合染料?

荧光DNA结合染料通常对活细胞是不渗透的,可以用多孔板格式检测培养中死亡细胞的积累。在选择染料时要考虑的最重要和实际的因素包括:发射波长、对DNA染色的选择性、细胞渗透性、在供应商推荐浓度下的溶解度、检测灵敏度和细胞毒性。容易穿过完整细胞膜并染色活细胞细胞核的含氟DNA染料不应用于测量死细胞。

Promega产品:CellTox™绿色细胞毒性检测(猫。# G8741)

我能实时测量细胞毒性吗?

是的,dna结合染料可以用来测量死亡细胞的时间,但是,重要的是要考虑细胞长时间暴露在染料中是否会影响它们的健康或反应能力。下图显示了三种不同的dna结合染料连续暴露于四种不同的细胞类型72小时后的效果,然后使用ATP测定细胞活力。

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乳酸脱氢酶(LDH)检测是如何工作的?

失去膜完整性的死细胞的存在可以通过测量从细胞质泄漏到培养基中的标记物来检测。这种检测方法最常用的标记物是乳酸脱氢酶。乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸转化为乳酸,并在此过程中转化NAD+NADH。NADH的还原能力可用于将各种底物分子还原为着色、荧光或发光的产物。leyu乐鱼网图5说明了用于检测死细胞细胞质中ldh释放的一般方案和检测化学方法。过量的乳酸和NAD+作为底物在试剂混合物中交付以驱动LDH生成丙酮酸和NADH。NADH的还原力被用来将底物(再青嘌呤)转化为生氟产物(再青嘌呤)。

该实验化学的比色法使用四唑化合物作为复照酶底物,将其转化为可以用分光光度计测量的颜色强烈的福马赞产品。同样,光度测定法可以使用“前荧光素”底物,将其转化为荧光素产物,与萤火虫荧光素酶反应相连接,产生发光信号。比色法是几十年前开发的,缺乏检测灵敏度。此外,由于缓冲液与活细胞不相容,需要将培养上清移到不同的容器中进行检测。荧光法比比色法更均匀,灵敏度更高。的luminogenic版本该方法的灵敏度远高于含氟版本,并可在不同时间采样2-5µl的培养上清,该上清可冷冻保存,以供未来分析乳酸脱氢酶释放的时间。

Promega产leyu乐鱼网品:LDH-Glo™细胞毒性试验(猫。# J2380),CytoTox-ONE™均匀膜完整性检测(猫。# G7890)

下载实验指导手册了解更多有关细胞毒性测定的知识。

用STR谱分析鉴定人细胞系

为什么鉴定人类细胞株很重要?

细胞系的错误识别和污染已成为生物医学研究中的一个严重问题。研究表明,细胞系之间的交叉污染发生的频率在16-35%之间。确认细胞系的确切身份对于解释实验结果很重要,因为从受污染的细胞系收集的数据可能导致错误的结论和不可复制的结果。因此,在使用所有细胞系之前对其进行认证是至关重要的。

什么是STR分析?

STR是“短串联重复”的缩写,它是包含1-6 bp核心序列的DNA片段,在整个基因组中连续重复多达数百次。每个STR基因座的重复数在不同个体之间有很大的差异。通过放大和分析不同STR基因座中重复的唯一数量,可以将细胞和组织的起源追溯到单个供体。

STR分析的优点是什么?

STR分析是一种被普遍接受的人体细胞系认证方法。这种方法在识别独特的人类细胞系的能力上是稳健的。可通过核心设施或服务提供商获得并负担得起。

如何进行STR分析?

许多学术核心设施或商业提供商提供STR分析服务。可以轻松地执行STR分析PowerPlex®18 d系统(猫。# DC1802),它允许四色荧光检测18个STR基因座,所有共同扩增同时在一个管。该系统是为分析常见的数据库样本而优化的,如直接从未经冲洗的样本采集卡穿孔中扩增。一般流程描述如下:

  1. 将细胞悬浮液直接放在样品采集卡上。
  2. 在样品点的中心冲一个圆盘,把它放在反应板的孔中。
  3. 加入适量的PowerPlex®18D 5X主混合液和5X底漆对混合液。
  4. 将平板放入热循环器中并开始放大。

下载实验指导手册以了解更多有关STR分析协议、如何解释STR数据和其他故障排除提示。

基于bret的蛋白质检测方法:活细胞中的蛋白质相互作用

为什么蛋白质相互作用很重要?

蛋白质:蛋白质相互作用(PPI)驱动活细胞中的动态过程。由于氨基酸长度、结合亲和力和复杂性的变化,这些蛋白质靶标难以监测。为了高通量筛选可能诱导或抑制这些复杂相互作用的化合物,需要能够检测细胞内PPI的敏感分析。为了收集最准确的数据,你的PPI分析应该在细胞环境的背景下反映活性。因此,在决定哪种PPI检测方法最适合您的实验需求时,应考虑细胞类型、转染方法、仪器读数和检测条件。

FRET和BRET分析的区别是什么?

在Förster共振能量转移(FRET)试验中,来自供体蛋白质的荧光能量被转移到受体蛋白质。当PPI复合物形成时,这种能量转移发出的光可被流式细胞仪或平板阅读器检测到。

生物发光共振能量转移(BRET)试验也是一种基于邻近性的试验,能量从荧光素酶供体转移,荧光蛋白作为受体。当使用优化的供体和受体蛋白时,该方法具有较好的信本比和动态范围。

从NanoLuc到HaloTag NanoBRET配体12749TA-W-a的能量转移

NanoBRET™检测是如何工作的?

NanoBRET™技术使用NanoLuc®融合蛋白作为生物发光供体,使用荧光标记的HaloTag®融合蛋白作为受体。与传统的BRET分析相比,明亮的、蓝移的供体信号和红移的受体创造了最佳的光谱重叠、增加的信号和较低的背景。

经过一些优化,NanoBRET™可以在任何可以转染的细胞系中进行。使用无酚红介质,以避免对受体信号的干扰。感兴趣的蛋白质可以在N端或C端用NanoLuc®荧光素酶或HaloTag®蛋白标记,产生多达8种可能的结构和8种可能的组合。可以使用全长蛋白或蛋白结构域。为了减少背景,提高动态范围,应确定最佳的供体和受体表达量的比例。

为了准确地进行NanoBRET™PPI分析,您需要一种可以连续测量双过滤发光值的仪器,该仪器配有适当的过滤器,如GloMax®发现系统(猫。# GM3000)。供体发射发生在460nm处,受体发射发生在618nm处。在数据分析中,通过受体信号除以供体信号来计算BRET比。然后,通过将该值乘以1000,原始BRET单位可以转换为毫厘BRET单位。

纳米bret的供体和受体信号波长

Promega产leyu乐鱼网品:NanoGlo®检测系统(猫。# N1661),NanoBRET™PPI启动系统(猫。# N1821)

下载实验指导手册以细胞为基础的PPI测定的更多信息。