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用一种新的基于平板的检测方法在二维和三维细胞培养模型中评估自噬通量

部分#PS316

摘要

丹·f·拉扎尔1阿曼尼·a·吉列(Amani A. Gillette)2布雷登·巴特勒著1克里斯托弗·埃格斯1布洛克·f·宾科夫斯基1, gedimas Vidugiris1迈克尔·r·斯莱特1,马东平1——特里·里斯1和詹姆斯·j·卡利1
1Promega公司,2800 Woods Hollow Rd, Madison, WI, 53711;2威斯康星大学麦迪逊分校


我们已经开发了一种基于均匀平板的检测方法来测量自噬通量,该方法适用于2D和3D细胞培养模型。用间隔序列和虾源荧光素酶(HiBiT)的一个小亚基标记LC3蛋白的n端。当在哺乳动物细胞系中以低到中等水平稳定表达时,这种基于lc3的新型报告蛋白通过自噬途径被处理。自噬报告因子的细胞水平是通过添加含有荧光素酶(LgBiT)大亚基和发光底物的裂解检测试剂来确定的。LgBiT与细胞裂解液中的HiBiT快速结合,产生活性NanoBiT荧光素酶,该酶产生与自噬报告物数量成正比的发光信号。稳定表达自噬报告基因并经自噬刺激剂处理的细胞,其发光信号会减弱。用自噬抑制剂治疗会导致lc3基报告蛋白水平的升高,从而产生更高的发光信号。自噬通量测定法可以与细胞毒性测定法重复使用(在同一样品上),作为检测被测化合物的细胞毒性效应的对照。该检测方法在使用U2OS和HEK293自噬报告细胞的384孔高通量自动筛选格式中具有优异的性能。发光的“辉光”信号可以稳定数小时,可以在同一个实验中批量处理多个96孔或384孔板。 Both induction and inhibition of autophagic activity was easily observable following reference compound treatment of HEK293 cells grown as 3D spheroids.

这种新的检测方法能够在二维或三维培养模型系统中筛选自噬通量调节剂,使用一个简单的均匀检测过程,用平板读数发光计记录。

在美国印刷。