使用NanoLuc®二元技术(NanoBiT)监测细胞内蛋白质相互作用

部分#PS272

摘要

Brock Binkowski, Christopher Eggers, Braeden Butler, Marie Schwinn, Michael Slater, Thomas Machleidt, Mei聪，Keith Wood和Frank Fan
Promega公司，麦迪逊伍兹空心路2800号，威斯康星州53711-5399

蛋白质:蛋白质相互作用(PPIs)是导致癌症的细胞信号转导途径所必需的。虽然有许多方法可以在体外监测PPIs，但细胞内检测的方法比较有限。我们开发了NanoLuc®二元技术(NanoBiT)，这是一种基于NanoLuc®荧光素酶的双亚基系统，可用于PPIs的细胞内检测。大一点(LgBiT;18 kDa)和Small BiT (SmBiT;11个氨基酸肽)的亚基被表达为感兴趣的蛋白质的融合，其中PPI促进亚基的互补，产生一个明亮的发光酶。与简单拆分酶或蛋白质的相关方法不同，LgBiT的结构稳定性是独立优化的，SmBiT是从专门用于PPI应用的肽库中选择的。结果得到了弱结合(KD = 190 μM)的亚基对，但在饱和状态下仍保持了全长NanoLuc 30%的活性。与许多分裂系统相比，LgBiT:SmBiT相互作用是可逆的，允许检测快速分离的蛋白质。使用Nano-Glo®活细胞试剂(含有细胞渗透性呋喃咪嗪底物的非溶性检测试剂)可以实时跟踪活细胞中的PPI动态。 Advantages over split systems include better sensitivity, reversibility, fusion to a peptide or a small, structurally stable protein domain, real-time measurements using a non-lytic assay format, and subunits with reduced affinity for self-association.

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